細胞收集，究竟哪種方案最合適？離心收集or瓶內裂解or胰酶消化？
不少科研人員都曾被這個難題困擾良久，尤其是看了大量的蛋白樣品制備的相關文章后，變得更加的不堅定了。有的文章推薦離心法，操作方便且高效；有的文章則推薦瓶內裂解，能最大程度保持細胞蛋白譜的完整性；還有的則推薦胰酶消化法，保持細胞形態單一，不聚團。貌似每種方法都可以，但是應用于實驗中結果卻不盡人意，我們先來了解一下細胞收集方法的優劣對比及操作步驟等。
一、細胞收集方法優劣對比
1、離心法
優點：離心法操作方便，同時我們可根據收集到的細胞沉淀來加入適量的裂解液，從而能夠控制樣品蛋白的濃度。
缺點：在離心過程中卻容易造成細胞破碎而降低總蛋白得率，同時會造成細胞外基質（ECM）的丟失，從而造成樣品蛋白質圖譜的不完整。
注：細胞外基質（ECM）是由細胞外大分子和礦物質（如膠原蛋白、酶、糖蛋白和羥基磷灰石）組成的三維網絡，為周圍細胞提供結構和生化支持。因為多細胞在不同的多細胞譜系中獨立進化，細胞外基質的組成因多細胞結構而異；然而，細胞粘附、細胞間通訊和分化是ECM的常見功能。細胞外基質主要由5類物質組成，即膠原蛋白、非膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖與氨基聚糖，按分布部位劃分主要分為基底膜（Basement membrane）和間質基質(Interstitial matrix)
2、瓶內裂解法
優點：瓶內裂解法最大的優點是可以有效的防止細胞在離心過程中破碎，能有效的提高總蛋白得率，同時也能完整的保留細胞外基質（ECM）。
缺點：操作會相對復雜，且不易控制加入的裂解液量，往往會造成總蛋白濃度低且粘度高等情況；對于一些藥物處理的細胞和貼壁不牢的細胞，使用此方法在清洗階段也容易造成細胞大量丟失。
3、胰酶消化法
優點：胰酶處理的細胞個體形態單一，不聚團，對細胞損傷小。
缺點：會造成細胞外基質（ECM）的完全丟失，同時會剪切一些對胰酶敏感的蛋白。
對于WB蛋白樣品中是否含有對胰酶敏感的蛋白，我們往往不太確定，同時胰蛋白酶也屬于外來蛋白質，如果不能做到徹底清除，同樣會污染我們的樣本。所以用于WB的細胞樣品不建議使用胰酶消化法收集細胞。
每一種方法都有自己的優勢和局限性，我們要根據自己的細胞類型選擇合適的細胞收集方式。
離心法：適用于懸浮細胞、貼壁不牢和藥物處理過的細胞；
瓶內裂解法：適用于所有的貼壁細胞；
胰酶消化法：適用于目的蛋白非細胞外基質（ECM）或對胰酶不敏感的蛋白。
在一般情況下，我們首推瓶內裂解法，其次離心法；不推薦胰酶消化法。
二、細胞收集protocol
了解了三個方法的優劣，選擇了最合適的細胞收集方法，那具體該如何操作呢？這里也給大家準備了瓶內裂解法和離心法的詳細Protocol，請查收：
a. 瓶內裂解法（效果最佳）：適用于所有的貼壁細胞
1）吸凈培養基，用冰的PBS清洗細胞表面2遍（動作輕柔，防止細胞脫落），盡可能吸取殘留的PBS。
2）在冰上加入適量預冷的裂解液于細胞瓶、培養板或培養皿中，用移液管吹散貼壁的細胞，對于貼壁緊的細胞也可使用細胞刮收集，收集裂解液，在冰上放置30min，期間每10min上下顛倒混勻一次。
b. 離心法：適用于懸浮細胞、貼壁不牢和藥物處理過的細胞
1）使用細胞刮收集細胞懸液（連同培養基一起收集），4℃，500g離心5min，收集沉淀，沉淀用預冷的PBS洗滌兩遍，收集細胞沉淀，盡可能吸取殘留的PBS。
2）加入適量的裂解液，在冰上放置30min，期間每10min上下顛倒混勻一次。
注：裂解液在使用前提前加入蛋白酶抑制劑，用于磷酸化抗體檢測的需要同時加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。
看到這里，各位科研同仁們應該已經完全掌握了吧！
